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Abb.1: Menschliche Zelle, bei der eine Proteinspezies mit einem Leuchtfarbstoff markiert wurde. Auf Grund der hohen Dichte erscheint die Unterseite der Zelle als eine homogen leuchtenden Fläche, es sind keine einzelnen Proteine oder Cluster erkennbar.
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Mario Brameshuber - Wenn Molekülen das Licht ausgeknipst wird
TOCCSL: Eine neue Methode zur Detektion von nanoskopischen Molekülclustern
oder
Wenn Molekülen das Licht ausgeknipst wird
Mario Brameshuber
angefertigt am Institut für Biophysik
Biologische Zellen stellen die kleinste lebende Einheit dar. Zum Beispiel besteht der menschliche Körper aus mehr als einhundert Billionen Zellen, die in einer hoch komplexen Art und Weise zusammenarbeiten und den menschlichen Organismus bilden. Die „Hülle“ einer Zelle, die sie gegenüber der Außenwelt abgrenzt, besteht aus seifenartigen Molekülen, den sogenannten Lipiden, die eine biologische Membran formen. In dieser befinden sich Proteine, die für die Ausführung verschiedenster Funktionen zuständig sind. Man benötigt beispielsweise eine gewisse Anzahl von Proteinen, um eine Pore zu formen, durch die ausschließlich bestimmte Teilchen ins Innere der Zelle oder auch heraus geschleust werden. Andere Proteine wiederum sind dafür zuständig, dass Signale ins Zellinnere oder zu benachbarten Zellen weitergeleitet werden. Insgesamt betrachtet besteht ein erheblicher Anteil der Membran aus solchen oder ähnlichen Proteinen, deren Größe und Abstand zueinander im Bereich von wenigen millionstel Millimeter oder darunter liegt. Dies ist der Grund dafür, dass Proteine und deren Aggregate, sogenannte Cluster, in Zellmembranen mit konventionellen optischen Methoden nicht getrennt beobachtbar sind (siehe Abb. 1),
Mit der am Institut für Biophysik etablierten Technik der Einzelmolekül-Mikroskopie war man bisher in der Lage einzelne, weit voneinander entfernte Moleküle, die zuvor mit Leuchtfarbstoffen markiert wurden, auf der Membran von lebenden Zellen zu verfolgen. Allerdings scheiterte man bei der direkten Visualisierung oben genannter Proteine und Cluster. Mit Hilfe einer neu entwickelten und in dieser Arbeit vorgestellten Technik ist es erstmals möglich diese kleinsten Strukturen sichtbar zu machen. Man macht sich dabei die Tatsache zu nutze, dass Farbstoffe durch extrem starkes Laserlicht zerstört werden können. Unter Ausnutzung dieses Effekts werden in einem etwa 4x4µm2 großen Bereich der Zellmembran alle an Proteine gekoppelte Farbstoffe gebleicht. Proteine und Cluster, die zuvor noch keinem Laserlicht ausgesetzt waren, gelangen infolge ihrer Eigenbewegung in diesen zuvor gebleichten Bereich. Wählt man den Zeitpunkt des erneuten Betrachtens korrekt, so gestattet die Dichte an Proteinen und Clustern im betreffenden Teil der Zellmembran, dass einzelne Moleküle beobachtet und charakterisiert werden können (siehe Abb. 2). Diese Methode gestattet den Zugang zu bisher nicht beobachtbaren Charakteristiken von Zellmembranen und erlaubt damit neue Einblicke in die Geheimnisse des Lebens.
Abb. 2: Zelle nach erfolgter Dichtereduktion (oben links) und nun beobachtbare, einzelne Proteine bzw. Cluster (unten links). Kennt man die Verteilung des Fluoreszenzsignal eines einzelnen Farbstoffes (oben rechts), so kann man berechnen, aus welchen Anteilen sich eine Verteilung des Fluoreszenzsignals von Proteinaggregaten zusammensetzt. Es lässt sich somit die mittlere Anzahl der Proteine pro Cluster bestimmen (unten rechts).