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2010 - Mario Brameshuber
Molekulare Erkennungsmechanismen bei der Aktivierung von T-Zellen
PostDoc Projekt: Forschungsaufenthalt am Department of Microbiology and Immunology, Stanford
University, USA
15.08.2010 – 15.02.2011
Mario Brameshuber
Contact: vorname.nachname(/\t)gmx.net
T Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei Antworten des adaptiven Immunsystems auf das Eindringen bzw. Vorhandensein von Krankheitserregern. Der erste Schritt bei der Aktivierung von T-Zellen ist die hoch spezifische und extrem sensitive molekulare Erkennung eines antigenen Peptids, also einem Fragment des Krankheitserregers, durch den T-Zell Rezeptor (TCR). Das Peptid sitzt dabei an der Oberfläche von Antigen Präsentierenden Zellen (APCs) . Nach Prozessieren des Antigens innerhalb der APC erfolgt diese Präsentation mit Hilfe des Major Histocompatibility Complexes (MHC).
Der erste Schritt dieser molekularen Erkennung von Peptid-MHC durch den TCR wurde kürzlich in Zusammenarbeit der Gruppen von Mark Davis und Gerhard Schütz untersucht und die überraschende Erkenntnis, dass die Kinetik der Bindung deutlich schneller ist, als in vitro Studien gezeigt haben, publiziert . Von besonderem Interesse ist dabei die lokale Rezeptordichte, da diese einen großen Einfluss auf die Interaktionskinetik hat. In der Gruppe von Mark Davis wurde gezeigt, dass der TCR nicht homogen auf der T-Zell Oberfläche verteilt ist, sondern in 100-200nm großen Protein-Islands clustert, die sich dann bei Aktivierung der Zelle nach der Antigenerkennung zu µm-großen Strukturen zusammenlagern .
An dieser Stellt knüpfte ich mit meinen Forschungen in Stanford an, um herauszufinden, ob die gesamte TCR-Population in Protein Islands aggregiert oder es sich dabei nur um eine Subpopulation handelt. Im ersten Schritt konnten wir mit Hilfe von hsPALM (high speed photoactivation microscopy (3)) zeigen, dass Inhomogenitäten der TCR-Verteilung auch dann vorhanden sind, wenn sich T-Zellen auf einem mobilen Lipid Bilayer System befinden. Letzteres dient zur „Simulation“ einer APC und beinhaltet neben dem Peptid-MHC II Komplex noch zwei weitere Proteine, die T-Zellen zur Adhäsion und zum vollständigen Aktivieren benötigen. Die ersten Experimente wurden auf nicht-aktivierenden Bilayern durchgeführt, um Inhomogenitäten im Ruhezustand der Zelle zu veranschaulichen. Die Ergebnisse hierzu waren jedoch nicht so deutlich, wie die publizierten Resultate. Dies lag in erster Linie daran, dass keine auf Oberflächen immobilisierten Proteine verwendet wurden, sondern ein mobiler Lipid Bilayer, der ein wesentlich besseres Modellsystem für eine APC darstellt.
Um die Mobilität der TCRs zu untersuchen, wurde eine Mischung aus Farbstoff-markierten und unmarkierten single-chain Fragmenten (scFv) gegen den TCR eingesetzt. Dabei handelt es sich um monovalente Bindeproteine, die jeweils nur einen TCR binden und auf Grund ihrer geringen Größe das Diffusionsverhalten der zu untersuchenden Proteine nicht verändern. Interessanterweise kann das Diffusionsverhalten des TCRs mit einem „confined Diffusion“ Modell beschrieben werden, bei dem der TCR nur innerhalb bestimmter Grenzen frei diffundieren kann. Möglicherweise handelt es sich dabei um die Diffusion der Proteine in den Protein-Islands. Um dies zu überprüfen, haben wir versucht, simultan ein Superresolution-Fluoreszenzbild mit Hilfe von hsPALM und eine Diffusion-Map mittels Diffusionsanalyse zu erstellen. Dies soll die direkte Korrelation der Diffusionsbewegung mit den detektierten Inhomogenitäten erlauben, um einerseits die gute Zeitauflösung und andererseits die hohe Strukturauflösung der beiden verwendeten Techniken nutzen zu können. Aufgrund technischer Limitationen ist dies jedoch noch nicht vollständig gelungen und soll deshalb mit anderen Farbstoffen noch einmal in den Labors in Österreich wiederholt werden, um die Resultate dann gemeinsam mit zuvor gewonnen Erkenntnissen publizieren zu können.
Da für die Kinetik aber auch die strukturellen Aspekte der Gegenseite der Interaktion, also die des Peptid-MHCII auf der Oberfläche von APCs, von großer Bedeutung sind, habe ich mich im zweiten Teil meines Forschungsaufenthalts in Stanford auf Studien an murinen B-Zellen konzentriert. Dazu musste ich zuvor zahlreiche molekularbiologische und biochemische Werkzeuge erlernen, um schlussendliche genetisch ein photo-aktivierbares Protein an das MHC II der B-Zelle zu koppeln. Mit dieser Sonde konnte ich mit Hilfe von hsPALM µm-große Domänen auflösen, die bei Verwendung von normaler Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie nicht sichtbar wären. Durch Verwendung eines Peptides, an das ein Farbstoff gekoppelt wurde, konnte das Diffusionsverhalten von MHC II untersucht werden. Hier war ebenfalls das Ziel, simultane hsPALM- und Diffusionsmessungen durchzuführen. Aufgrund des großen Aufwands und der Vielzahl an Messungen konnten bis zum Ende meines Aufenthalts in Stanford noch nicht alle Daten analysiert werden. Erste Analysen zeigen aber vielversprechende Eigenschaften auf, die ich nun mit neuen Studien hier in Österreich weiterverfolgen will.
Zusammenfassend hatte ich in Stanford nicht nur die Gelegenheit, mein Know-How im Bereich der Einzelmolekülmikroskopie einzubringen und auf Grund dessen einige neue Kooperationen aufzubauen, sondern habe vor allem Einblicke in Techniken und Methoden der Biochemie, Molekularbiologie und Immunologie bekommen. Neben der kompletten Herstellungsprozedur von Proteinen und der Fluoreszenzmarkierung samt Aufreinigung von Peptiden mit Hilfe von verschiedenen Chromatographietechniken, konnte ich im B-Zell Projekt eine eigene Klonierungsstrategie entwickeln und erfolgreich anwenden. Durch die Arbeit mit murinen T-Zellen konnte ich erlernen, wie diese Zellen aus Mäusen gewonnen werden und für die weitere Verwendung kultiviert und mit zuvor hergestellten Viren behandelt werden müssen, bevor die Zellen für verschiedenste Experimente mit dem Fluoreszenzmikroskop verwendet werden können.
Referenzen
1. J. B. Huppa, M. M. Davis, Nat Rev Immunol 3, 973 (Dec, 2003).
2. J. B. Huppa et al., Nature 463, 963 (Feb 18, 2010).
3. B. F. Lillemeier et al., Nat Immunol 11, 90 (Jan, 2010).