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Location Physics-Building

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2016 - Mirjam Zimmermann

Translokation hydrophober Segmente

Research stay at the Vorname.Nachname(/\t)unibas.ch

Mein Aufenthalt in Basel diente (neben dem Erlernung neuer Techniken) hauptsächlich der Forschung am Sec61 Proteintranslokationskanal. Dieser eukaryotische Kanal ist dem prokaryotischen SecYEG Translokationskanal (mit dem ich mich während meiner gesamten Dissertation befasse), strukturell und funktionell sehr ähnlich.

In meiner Doktorarbeit an der JKU studiere ich die Translokation und Integration diverser hydrophober Segmente. Mittels spektroskopischer Methoden werden diese Vorgänge in vitro analysiert. Im Gegensatz dazu findet die Forschung in Basel in vivo im Modelsystem Hefe statt. Prof. Martin Spiess ist ein Fachmann auf diesem Gebiet und mein Auslandsaufenthalt bot mir eine hervorragende Chance zur beruflichen und wissenschaftlichen Weiterentwicklung.

Meine Forschungsarbeit in Basel betraf vor allem die Bindung von BiP (ein die Translokation unterstütztendes Chaperon) an eine zu translozierende Peptidkette. Zusätzlich wurde diese Kette in die Lipidmembran integriert; dazu wurden hydrophobe Segmente mittels Klonierung inseriert und analysiert. Je nach Art dieses hydrophoben Segments kann man diesen Prozess beeinflussen.

Beispielsweise kann die Verlängerung der wachsenden Peptidkette zu einer Destabilisierung des Lipid-Peptidkontaktes führen und mit der Bindung des BiP Chaperons in einer vollen Translokation in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums resultieren. Das System wurde in weiterer Folge so verändert, dass entweder die Translokation oder die Inserierung eines Hydrophoben Segments in die Membran gezielt begünstigt wird. Konkret benötigt diese Forschung die Anwendung vielfältiger molekularbiologischer Techniken: zuallererst müssen Plasmidkonstrukte hergestellt werden, welche einen Signalanker, ein N-terminales Peptid von ca. 100 Aminosäuren, und ein hydrophobes Segment gefolgt von einer etwa 200 Aminosäuren bestehenden Kette beinhalten. Darüber hinaus wird die N-Terminale Sequenz verändert bzw. das Konstrukt mit Glykosylierungsstellen versetzt. Diese Änderungen beinhalten Sequenzen an welche BiP entweder sehr gut oder kaum (Abfolge von Glycin/Serin) binden sollte. Diese Konstrukte werden schlussendlich in Hefe transformiert, es wird eine Isotopen Pulsmarkierung durchgeführt, und mittels Immunopräzipitation extrahiert und durch Autoradiographie analysiert. Schließlich werden temperatursensitive Mutanten von BiP generiert und Wildtyp mit Mutanten bei permissiver und restriktiver Temperatur verglichen.